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Artículo Breve


SIMPLIFICACIÓN EN EL CONTEO DE LINFOCITOS T CD4 POSITIVOS EN PERSONAS CON INFECCIÓN POR VIH/SIDA EN MÉXICO*

*Una parte de este trabajo se presentó en la IX Conferencia Internacional sobre SIDA; Berlín, Alemania, 1993 (resumen número WS-BO2-4).

Salud Pública Méx 1996; Vol. 38(3):207-212

Indice

Autores


JEANNETTE GUARNER, M.C.,(1) GERARDO SÁNCHEZ-MEJORADA-FERNÁNDEZ, M.C.,(2) CARLOS DEL RÍO-CHIRIBOGA, M.C.,(3) ALEJANDRO MOHAR, M.C., DR. EN C.(4)


(1) Jefa de la División de Servicios Auxiliares de Diagnóstico y Tratamiento, Instituto Nacional de Cancerología (INC), México.
(2) Jefe de la División de Investigación Clínica, INC. Actualmente Gerente de Investigación en Sanofi-Winthrop, México.
(3) Coordinador General del Consejo Nacional para la Prevención y el Control del SIDA (CONASIDA), México.
(4) Subdirector de Investigación, INC, México.

Resumen

Objetivo. Correlacionar el conteo de células CD4 positivas y linfocitos totales (LT), así como disminuir el costo de la prueba. Material y métodos. En 175 pacientes infectados por VIH se determinó la cuenta de CD4 mediante citometría de flujo, siguiendo las recomendaciones actuales (positividad dual para CD3 y CD4). Se analizó la diferencia entre el porcentaje de células CD3/CD4 dualmente positivas y aquéllas únicamente positivas para CD4. Además, mediate regresión lineal se correlacionaron prospectivamente los valores de LT y células CD4 positivas en 500 personas infectadas con VIH, y se estudió el número de casos discrepantes para cuentas menores de 200 células CD4 positivas, en relación con cuentas de LT menores de 1 500 y de 2 000 células/µl. Resultados. En los primeros 175 casos se encontró que la media para la subpoblación CD3/CD4 positiva fue de 13.8%, y para CD4 total de 14.2%, diferencia que no fue estadísticamente significativa. La diferencia entre ambas mediciones varió de 0 a 4.8%, con una media de 0.4 y una mediana de 0.2%. La correlación lineal entre LT y CD4 de los 500 pacientes restantes fue de 0.59; la media de LT fue 1 700 células/µl, y de los CD4 219 células/µl. Conclusiones. La correlación entre LT y CD4 es muy pobre, por lo que no es posible predecir las cuentas de CD4 a partir de la cuenta de linfocitos obtenida de una biometría hemática. La diferencia entre medir dualmente CD3/CD4 y sólo CD4, no fue significativa. Estos datos sugieren que medir únicamente CD4 disminuye costos y es una alternativa clínicamente útil.

Palabras clave: linfocitos T; VIH; SIDA; México

Abstract

Objective. To study the correlation between ALC and CD4 cell counts and to find alternative ways of counting CD4+ T-lymphocytes. Material and methods. The double positivity for CD3/CD4 antibodies was measured in 175 consecutive HIV-positive patients using flow cytometry; in these cases a difference was made between counting cells that were positive for both antibodies vs those that were positive only to CD4. ALC and CD4 counts were also compared among 500 subjects infected with HIV, using linear regression analysis and comparing the number of dissimilar cases for counts below 200 cells/µl and ALC counts lower than 1 500 and 2000 cells/µl. Results. In the 175 cases measured by the CD3/CD4 antibody combination the mean percent was 13.8% and for total CD4 cells 14.2% (p= NS); the mean difference was 0.4% and the median 0.2%. For the 500 patients the mean ALC was 1 700 cells/µl and the mean CD4 count was 219 cells/µl; the correlation coefficient was 0.59. Conclusions. These data suggest a poor correlation of ALC and CD4 cell counts, thus it is impossible to predict CD4 on the basis of ALC. This is the reason why it is necessary to measure CD4 cells separately. The difference between measuring double positive CD3/CD4 cells vs only CD4 positive cells was not significant. Our data suggest that the use of a single CD4 antibody may cut costs and still produce clinically useful information.

Key words: T lymphocytes; HIV; AIDS; Mexico


Solicitud de sobretiros: Dra. Jeannette Guarner. División de Servicios Auxiliares de Diagnóstico, Instituto Nacional de Cancerología. Av. San Fernando 22, Tlalpan, 14000 México, D.F.

Introducción

EL CONTEO DE linfocitos CD4 positivos (T cooperadores) es uno de los parámetros más importantes en los que se basan las decisiones terapéuticas  para pacientes infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).1-6 En la historia natural de la enfermedad se aceptan tres puntos de corte, que son clínicamente relevantes: a) por debajo de 500 células/µl es indicación para iniciar tratamiento con zidovudina;4,6 b) por abajo de 200 células/µl aumenta el riesgo de tener neumonía por Pneumocistis carinnii y, por tanto, se recomienda iniciar profilaxis primaria con trimetoprimsulfametoxasol; 2,3 y, c) cuentas menores de 100 células/µl se encuentran en personas con infección por Micobacterium avium-intracellulare, por lo que también se ha recomendado profilaxis contra este patógeno.5 Además, a partir de 1993 la definición epidemiológica de caso de SIDA utilizada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, incluye a personas infectadas por VIH con cuentas de  células CD4 inferiores a 200/µl.7

A partir de 1992 en los países desarrollados se ha establecido una serie de lineamientos para la realización correcta del conteo de células CD4;8-11 se propone el uso de citometría de flujo y un panel de 12 anticuerpos monoclonales combinados: CD45/CD14 (para enmarcar una ventana); CD3/CD4 (para medir linfocitos T cooperadores); CD3/CD8 (para medir linfocitos T supresores); CD3/CD19 (para separar la población de linfocitos T y B); CD3/CD56 (para separar las células NK); y, el control de anticuerpos de isotipo. Asimismo, en México se han publicado trabajos6,12 donde se sugiere la conveniencia de utilizar un panel semejante para el conteo de células CD4 positivas, considerando un mínimo de seis anticuerpos.

En los países en desarrollo no es frecuente que se realice el conteo de linfocitos CD4, ya que son pocos los laboratorios que cuentan con citometría de flujo (instrumento muy costoso, que puede leer dos fluorescencias simultáneamente) y el panel de anticuerpos recomendado es tan amplio que su costo es inaccesible. Como forma alternativa de lectura de los anticuerpos conjugados con tinciones fluorescentes, se puede utilizar un microscopio tomando en cuenta que habitualmente sólo se cuentan 200 células en cada caso, en comparación con 5 000 al usar citometría de flujo, por lo que la variabilidad es mayor.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) reconoce la necesidad de buscar alternativas menos costosas que puedan ayudar en las decisiones terapéuticas, por lo que se ha propuesto el uso de la cuenta total de linfocitos.13 Esta se obtiene de la biometría hemática y de la cuenta diferencial de linfocitos, pruebas que son de bajo costo y ampliamente utilizadas. En el presente trabajo se buscó disminuir costos al utilizar solamente el anticuerpo anti/CD4 en lugar del combinado CD3/CD4; además, se investigó la correlación entre células CD4 positivas y linfocitos totales.

Material y Métodos

Se estudiaron prospectivamente subpoblaciones linfocitarias en 175 personas infectadas por VIH, utilizando citometría de flujo (Epics Profile II, Coulter, Hialeah, FL), anticuerpos combinados CD3-FITC/CD4-RD1 (Coulter, Hialeah, FL) y controles de isotipo correspondientes (MsIgG1-FITC/MsIgG1-RD1, Coulter, Hialeah, FL). En dos tubos se incubó sangre total con las combinaciones de anticuerpos antes mencionadas, durante 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó un procedimiento de lisis de glóbulos rojos con fijación y estabilización de los glóbulos blancos, utilizando el sistema Q prep (Coulter, Hialeah, FL). La muestra se leyó en un citómetro de flujo contando 5 000 células presentes en la ventana creada a partir del tamaño (forward scatter) y granularidad (side scatter) de las células nucleadas sanguíneas (manual del instrumento). En este grupo de pacientes se buscó la diferencia en el porcentaje de aquellas células que fueron doblemente positivas para CD3 y CD4, vs las que fueron positivas únicamente para CD4. De estos datos se obtuvieron el rango y la media, así como la media, mediana y moda de las diferencias.

Asimismo se estudiaron, de manera prospectiva, las células CD4 positivas en 500 personas con infección por VIH cuya determinación se realizaba por primera vez, y a 30 sujetos control (trabajadores del laboratorio en el Instituto Nacional de Cancerología). En ellos las cuentas absolutas de linfocitos T cooperadores se calcularon obteniendo la cuenta de linfocitos totales de la biometría hemática (realizada en el instrumento MaxM de Coulter, Hialeah, FL) y este número se multiplicó por el porcentaje de células CD4 (totales, sin tomar en cuenta CD3). Se calcularon media y rango para los linfocitos totales, porcentaje y valor absoluto de CD3 y porcentaje y número absoluto de CD4. Se evaluó cada caso para determinar si existían discrepancias en cuentas de CD4 abajo de 200 células/µl comparando con cuentas de linfocitos totales por debajo de 1 500 y 2 000 células/µl. Se obtuvo sensibilidad y especificidad para los diversos puntos de corte. A través de la regresión lineal (programa STATA), se obtuvo el coeficiente de correlación para LT y células CD4.

Resultados

De los 175 pacientes en que se estudió la posibilidad de eliminar el anticuerpo CD3 y su control de isotipo, se encontró que la media del porcentaje de células doblemente positivas (CD3/CD4) fue de 13.8% (rango de 0 a 45.8%) y aquéllas con marcaje para CD4 total, de 14.2% (rango de 0 a 50.6%); la diferencia entre estas poblaciones no fue estadísticamente significativa. La diferencia entre la medición doble y la sencilla fue de 0 a 4.8%, con una media de 0.42, mediana de 0.2 y moda de 0.1%. La distribución de la media y rango de los diferentes parámetros en los 500 pacientes estudiados se presentan en el cuadro I; la media del porcentaje de CD3 fue de 71%, y la media para la cuenta de CD4 fue de 219 células/µl. El coeficiente de correlación no corregido entre la cuenta de CD4 y los linfocitos totales fue de 0.59 (p< 0.001). En el cuadro II se presentan las tablas de dos por dos, donde se calcularon sensibilidad y especificidad para linfocitos totales y CD4. Se presentan datos que toman en cuenta dos niveles de corte para los linfocitos totales, ya que todavía no se ha establecido cuál de estos valores es el que se debe considerar para las decisiones clínicas. La sensibilidad es menor con cuentas de linfocitos totales por debajo de 1 500 células/µl, que con cuentas menores a 2 000 células/µl. El número total de casos discrepantes al utilizar cuentas de linfocitos totales por abajo de 1 500 células/µl fue de 161, mientras que para cuentas inferiores a 2 000 células/µl fue de 164.


 

Discusión

La medición de cuentas de linfocitos T CD4 positivos en pacientes con infección por VIH se ha considerado importante para el pronóstico y para tomar decisiones clínicas terapéuticas. Así, por ejemplo, la profilaxis con trimetoprim-sulfametoxasol se recomienda para pacientes con cuentas abajo de 200 células/µl.1-6,14 Asi mismo, esta prueba de laboratorio la toman en cuenta los CDC para la definición de casos de SIDA.7 Por estas razones, las personas infectadas con el VIH requieren de mediciones frecuentes de CD4.

Recientemente la OMS ha propuesto una estadificación de la infección incorporando la cuenta de linfocitos totales, ya que en países en desarrollo es difícil el conteo de CD4 debido al alto costo de la prueba.13 En este estudio se comparó la cuenta de CD4 con los linfocitos totales, encontrando una pobre correlación (coeficiente de correlación de 0.59). Se demostraron discrepancias en el 30% de los casos, utilizando dos puntos de corte para los linfocitos totales. Aunque estos resultados son, aparentemente, diferentes a los encontrados por otros autores,15 las sensibilidades y especificidades informadas son similares a las presentadas en este trabajo. Por estas razones se concluye que no es posible sustituir el conteo de CD4, y se buscan otras alternativas que pudieran disminuir los costos de este estudio de laboratorio.

El panel recomendado por los CDC y los Institutos Nacionales de Salud en los Estados Unidos (NIH)8-10 es extraordinariamente costoso, ya que no sólo se miden linfocitos T cooperadores, sino también otras células que hacen el conteo del estudio linfocitario mucho más completo (linfocitos B, células NK, etc.). Sin embargo, estos costos son con frecuencia inaccesibles en países con recursos limitados, por lo que es imperativo buscar alternativas para las mediciones de células CD4. Los datos presentados sugieren que es posible utilizar menor número de anticuerpos para obtener la cuenta absoluta de CD4. Se disminuye el costo al no medir ni leer las células positivas para CD3 (linfocitos T) y su control de isotipo correspondiente. El uso del marcador CD3 permite garantizar con absoluta seguridad que las células CD4 son linfocitos T.8-10 Existen varios argumentos en contra de la utilización de este anticuerpo; uno de ellos es que el VIH no solamente infecta a los linfocitos CD3 y CD4 positivos, sino también a monocitos, que son las células que con mayor frecuencia se confunden con los linfocitos, tanto en microscopía como en citometría.16 Por otra parte, en los 175 casos donde se buscó la diferencia entre la medición de células CD3 y CD4 dualmente positivas y aquéllas CD4 positivas, se encontró que ésta era muy pequeña (en la mayoría de los casos menor de 0.5%), por lo que se considera que es posible dejar de medir CD3.

Otra controversia que se presenta con frecuencia es la discrepancia que puede existir entre usar números absolutos de CD4 o el porcentaje.17,18 El porcentaje es la medición que se obtiene de cualquiera de los instrumentos que se utilizan para lectura. Este será modificado por la biometría hemática de cada paciente, de tal manera que personas con el mismo porcentaje de CD4, al tener cuentas diferentes de glóbulos blancos o porcentajes distintos de linfocitos en la cuenta diferencial, poseerán números absolutos de CD4 muy distintos; por eso es que siempre es indispensable una correlación entre la presentación clínica del paciente y los valores en porcentaje y número absoluto de CD4.19

En conclusión, en este trabajo se encontró una pobre correlación entre la cuenta absoluta de linfocitos T CD4 positivos y los linfocitos totales, lo que hace difícil su uso cuando es necesario tomar decisiones de orden terapéutico. Estos datos sugieren que se pueden disminuir costos al eliminar del panel el anticuerpo para CD3 y su control de isotipo, de tal forma que sólo se realicen mediciones para CD4 y el anticuerpo control correspondiente.

Referencias

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